高璞/张立国团队与合作者揭示SLC19A1转运CDN、叶酸和抗叶酸的完整机制

　　环二核苷酸（cyclic dinucleotides，CDNs）是一类重要的信号分子，在天然免疫调控中发挥关键作用。哺乳动物细胞中，天然免疫受体cGAS感知细胞质中的异常DNA后，催化产生2'3'-cGAMP这一特殊的CDN分子，其可结合并激活接头蛋白STING，进而诱发广泛的免疫应答。cGAS-cGAMP-STING通路的重要性已超出普通天然免疫通路的范畴，在感染免疫、肿瘤免疫、自身免疫、细胞自噬和衰老等方面都发挥关键作用。

　　近年来，胞外CDN的免疫调节功能逐渐受到关注，其跨膜转运机制成为领域内的前沿科学问题。2019年，两项全基因组筛选研究发现SLC19A1是CDN跨膜转运的关键蛋白。SLC19A1不仅介导自身合成的2'3'-cGAMP的摄取，还能转运细菌源CDN以及人工合成的CDN药物。与此同时，SLC19A1也是叶酸吸收和抗叶酸类抗癌药物转运的重要通道，兼具营养吸收与药物转运的双重功能。这种多底物识别能力使其成为调控免疫和代谢的重要靶点。

　　为了阐明SLC19A1的多底物识别机制，中国科学院生物物理所的高璞/张立国团队和北京理工大学的高昂团队合作，于2022年（Nature,2022）报道了人源SLC19A1向细胞内开口状态（inward-open）的结构。结构显示，叶酸和抗叶酸以单体形式结合在其经典口袋，而CDN则以二聚体形式占据非经典口袋。然而SLC19A1转运过程的构象变化、底物选择性以及转运CDN的精确分子机制仍有待阐明。2025年4月2日，该联合团队在《Nature Communications》杂志上发表论文《Molecular basis ofSLC19A1-mediated folate and cyclic dinucleotide transport》，系统回答了上述科学问题。

　　针对纯化的SLC19A1样品存在固有偏好inward-open构象的问题，研究团队开发出创新性的抗体辅助构象锁定突变体筛选策略。利用前期获得的inward-open特异性抗体，通过流式细胞技术高效筛选获得G307F突变体，成功将蛋白稳定在向外开口（outward-open）状态（图1）。这种策略避免了繁琐的突变体蛋白纯化和结构分析步骤，可以快速筛选到能够锁定特定构象、且不影响底物结合的突变体。基于此突破，研究团队分别解析了SLC19A1outward-open状态无底物以及结合不同底物的复合物结构，包括还原型叶酸（5-MTHF）、多种抗叶酸（MTX和PT523）、向外运输的耦合阴离子（TPP）和人工合成的CDN药物（2'3'-CDA^S）。

图1: 抗体辅助的outward-open突变体筛选

　　通过与inward-open结构比对和突变体实验验证，研究人员确定了参与构象变化的重要氨基酸组成。Outward-open状态下，叶酸和抗叶酸仍以单体形式结合在SLC19A1中央经典底物口袋中，耦合离子TPP也以与叶酸/抗叶酸类似的方式结合在相同口袋中。然而有趣的是，与inward-open状态的二聚体结合方式不同，CDN分子以单体形式结合在outward-open经典口袋中。尽管叶酸和CDN化学结构上有一定的相似性且都结合在经典口袋，二者与SLC19A1的相互作用模式却明显不同（图2）。叶酸分子头部喋呤基团占据了蛋白的负电荷口袋，主要与N端结构域互作；而CDN分子主要占据了蛋白中央的正电荷区域，且同时与N端和C端结构域产生广泛互作。系统性突变体分析发现CDN特异性互作残基突变显著抑制CDN转运而不影响叶酸吸收，为后续设计底物选择性抑制药物提供了理论基础。

　　此外，新型抗叶酸药物PT523此前被报道仅作用于SLC19A1，而不能通过靶向其他叶酸/抗叶酸转运蛋白发挥功能，但其特异性的作用机制并不清楚。我们的结果表明，SLC19A1的N端结构域形成一处特异性口袋，恰好容纳PT523含有的特殊γ-羧酸修饰，而这一互作界面在其他叶酸/抗叶酸转运蛋白中并不存在，这为新一代抗叶酸药物的开发和优化提供了分子基础。

　　总的来说，该联合团队的这项研究在其前期工作的基础上，进一步揭示了SLC19A1转运过程的构象变化，以及其介导叶酸、抗叶酸和CDN跨膜转运的分子机制，不仅深化了对多底物转运蛋白工作机制的理解，更为开发靶向SLC19A1的免疫调节药物和精准化抗叶酸疗法提供了分子基础。而inward-open下的CDN二聚体结合模式，也为SLC19A1特异性抑制剂开发提供了潜在思路（图2）。

图2：SLC19A1底物转运模式图

　　博士后张启祥、副研究员张旭媛和博士生刘可欣为本文的共同第一作者；高璞研究员、张立国研究员和高昂教授为共同通讯作者。该项研究获得国家自然科学基金、国家重点研发项目、北京市自然科学基金等项目的资助。

　　相关论文链接：

　　https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36265513/

　　https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40175380/

（供稿：高璞研究组）