窥探衰老:中科院发展新型三维基因组成像系统

　　2017年4月7日，Cell Research杂志发表了中科院生物物理研究所刘光慧课题组和徐涛课题组，以及中科院动物研究所曲静课题组合作的题为"Visualization of Aging-Associated Chromatin Alterations with an Engineered TALE System" 的研究论文（封面故事）。该研究发展了一种新型三维基因组活细胞成像工具TTALE，并利用该系统实现了对端粒缩短和着丝粒构象变化等衰老伴随的染色质结构改变的精准成像。此外，该研究发现了核仁区核糖体DNA拷贝数减少可以作为人类衰老的新型分子标志物。上述成果为在遗传和表观遗传水平认识人类衰老的本质奠定了基础。

　　近年来，CRISPR/Cas9和TALE等新型核酸结合蛋白的发现和广泛应用使得对基因组特定序列的精准成像成为可能。然而，目前基于dCas9和TALE的成像系统尚存在一定的不足：dCas9系统的主要问题是由于其涉及多种蛋白和RNA元件，且dCas9蛋白分子量较大，因而该系统在哺乳动物细胞中瞬时表达存在难度，同时利用该系统成像时细胞核背景噪音也较高；TALE系统尽管蛋白分子量小，并可直接结合DNA，但目前发表的论文，尤其是利用人类细胞进行的基因组成像研究中，很少使用三维荧光原位杂交（3D-FISH）这一“金标准”实验对TALE成像的精确度进行严格确证。

　　在该项研究中，研究人员通过对传统TALE介导的端粒、着丝粒和核仁区核糖体DNA等基因组重复序列的成像结果进行细致分析，发现利用传统TALE标记基因组重复序列时会在细胞内产生异常的聚集斑块，且这些聚集斑块多数情况下脱离了基因组上的DNA靶序列，因而极大地限制了TALE在染色质三维成像中的应用。研究团队通过筛选一系列可提高细胞内蛋白溶解性的“助溶解多肽”，发现硫氧还蛋白（Thioredoxin）与TALE的融合表达（该融合蛋白称为TTALE）能够特异地清除TALE成像时伴生的聚集斑块，从而最大程度地释放TALE在染色质三维成像方面的效能。实验结果表明，同CRISPR/dCas9系统相比，TTALE具有成像信噪比高及易于操作等优点，可广泛应用于胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、成体干细胞（间充质干细胞和神经干细胞）、终末分化细胞（神经元和血管平滑肌细胞）、肿瘤细胞以及卵细胞等多种人类细胞类型。此外，利用该工具，研究者们首次实现了对28S核糖体DNA的活细胞标记，并揭示28S核糖体DNA主要分布于核仁区的外缘，这将为理解核糖体DNA和核仁在多种生命过程中的功能提供重要的线索和研究工具。

　　人类衰老和许多衰老相关的疾病都伴随着染色质结构的改变或异常，因此探索染色质结构的动态变化对于深入理解衰老及衰老性疾病的机制具有重要的意义。基因组重复序列是隐含在人类基因组中的“暗物质”，通常被包裹在致密的异染色质中，并且被认为是无用的“垃圾序列”。由于研究手段的限制，在现有的大多数基因组信息分析中，这些“垃圾序列”往往会被主观地“忽略”掉。人们所熟知的端粒也是一种基因组重复序列，同时端粒的缩短也已经成为衰老研究领域中为数不多的重要分子标志物之一。尽管如此，对于衰老是否伴随更为广泛的基因组重复序列的改变，目前人们还知之甚少。研究人员首先利用TTALE系统在培养皿中观测到了细胞衰老伴随的端粒缩短和着丝粒异染色质失序等基因组结构的变化，并且首次在体内单细胞水平观察到了端粒酶缺失小鼠的端粒加速缩短现象。更为重要的是，利用TTALE成像系统，研究团队发现核仁区核糖体DNA拷贝数的减少可能是人类衰老的生物钟之一。人类衰老所伴随的核仁区核糖体DNA拷贝数的减少与端粒的缩短同样显著，并且可以便捷地从老年人外周血中检出，因此可以用作评价人类衰老进程的新型分子标志物。

　　该研究为揭示人类染色质三维结构及其动态变化在衰老和疾病中的作用提供了有力的研究工具。此外，全新人类衰老分子标志物的确立也将为衰老的基础和转化研究提供助力。该工作被Cell Research杂志遴选为封面文章，同期美国Buck衰老研究所所长Brian K. Kennedy发表Research Highlight，对该工作予以高度评价：（1）“（对于衰老研究领域而言）成功实现对核仁区核糖体DNA的活细胞成像是一项里程碑式的工作。作为基因组不稳定性的重要诱因，核糖体DNA拷贝数的减少可能是真核生物衰老的驱动力之一”；（2）“TTALE系统的应用可能将不只局限于研究人类衰老等生理过程，对于自闭症和肿瘤等人类疾病的研究，甚至基因治疗都将具有潜在价值。”

　　该项工作由中科院生物物理所、中科院动物所、北京大学第三医院、国家卫计委北京医院，首都医科大学附属北京世纪坛医院，以及杭州师范大学等机构合作完成。中科院生物物理所刘光慧研究员、徐涛研究员以及中科院动物所曲静研究员为共同通讯作者。中科院生物物理所副研究员任若通博士、博士研究生邓丽萍、以及高级工程师薛艳红博士为并列第一作者。该工作受到科技部、基金委和中科院等项目的资助，相关技术已申请发明专利。

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　　Figure 1：TTALE介导的28S核糖体DNA在细胞核仁区的精准成像（左）；Cell Research封面（右）

Figure 2：TTALE成像系统可用于观测衰老伴随的端粒缩短、核仁区核糖体DNA拷贝数的减少，以及着丝粒异染色质去致密化等染色质结构的改变

（供稿：刘光慧课题组）