朱平研究组利用冷冻电子断层三维成像方法
揭示体外组装和体内染色质纤维一种普遍存在的双螺旋折叠模式

　　2023年9月13日，Cell Reports杂志在线发表了中国科学院生物物理研究所朱平研究组题为"Cryo-ET study from in vitro to in vivo revealed a general folding mode of chromatin with two-start helical architecture"的研究论文。在该论文中，研究者通过冷冻电子断层三维成像方法（Cryo-Electron Tomography, Cryo-ET）分别研究了体外组装的长染色质纤维，从HeLa细胞中提取的染色质纤维以及蛙血红细胞核内的原位染色质纤维结构，发现这些由连接组蛋白介导形成的染色质纤维具有一种普遍存在的双螺旋two-start zigzag结构。研究结果表明，不管是体外组装的染色质、从细胞核内提取的染色质纤维还是体内的原位染色质，其局部均遵循一种统一的双螺旋ZigZag折叠模式（图1）。虽然各种复杂环境及因素会导致染色质组成成分及相互作用的不均一性，并由此导致染色质整体结构的复杂多变，但染色质纤维局部核小体排列仍然满足一种普遍的two-start zigzag折叠模式。

图1 体外、体内染色质纤维一种普遍存在的双螺旋zigzag折叠模式

　　在高等生物个体的发育和分化过程中，生命体通过各种表观遗传调控染色质高级结构的动态变化，进而调控基因的开放，关闭和转录水平，从而决定细胞的组织特异性和细胞命运。因此，染色质的高级结构、动态变化及其调控机制对于理解生命过程的本质具有重要意义，也是现代分子生物学的基本问题之一。在之前的研究中，朱平研究组和李国红研究组合作，利用冷冻电镜单颗粒分析方法（Cryo-EM SPA），对体外组装、由12个核小体重复长度（NRL）为177 bp或187 bp的均一核小体组成的染色质纤维颗粒（12x177 bp, 12x187 bp）进行三维结构重构，发现其具有一种特殊的双螺旋two-start zigzag结构（Song et al., Science 2014），这些结果为理解染色质高级结构和折叠的分子机制提供了重要信息。

　　然而，细胞核内高度密集的染色质情况极为复杂，染色质折叠和高级结构形成过程受各种不同的表观调控因子的影响，使得体内染色质原位结构研究非常困难，染色质原位结构及组成也具有较大争议。比如，体外组装的染色质纤维，其结构是否随着纤维长度（核小体个数），核小体之间连接DNA长度（或核小体重复长度NRL）以及各种表观遗传修饰的变化而改变？此外，与体外组装染色质所处的相对简单和均一的环境不同，细胞核内染色质的复杂成分和环境条件对染色质折叠有多大影响？体外和体内染色质是否具有一种普遍适用的折叠模式？针对以上问题，朱平研究组新发表的研究论文系统地比较了体外组装，细胞提取以及细胞核内三种染色质纤维的结构。

　　首先，研究者利用冷冻电子断层三维成像方法解析了体外组装的由50个核小体组成的长染色质，核小体重复长度NRL长度为200 bp（50x200 bp）的长染色质纤维结构。结果显示，染色质长度以及NRL的增加大大地增强了纤维的柔性。尽管如此，染色质在短程的范围内仍然具有较为均一的亚结构单元。通过局部亚单位平均（sub-tomogram averaging, STA）结果显示该亚单元仍然具有two-start zigzag的结构。

　　其后，在对从HeLa细胞核内提取的染色质纤维结构解析中，研究者发现由于细胞内DNA序列以及NRL的随机性较强，此外组蛋白与DNA的各种表观遗传修饰也具有多样性与随机性，因此提取的染色质纤维的结构具有很强的异质性。通过对核小体之间的距离，角度，以及纤维扭曲程度等参数的统计分析，发现这种异质性染色质纤维中的均一结构比例比体外组装的均质染色质纤维要低很多。针对这种难以用STA方法平均的结构，研究者利用空间密度分割的方法直接定位了各个核小体的三维空间位向。结果显示提取的染色质纤维中核小体排列也都满足类似的two-start zigzag规律。

　　更进一步，研究者结合冷冻聚焦离子束超薄切片（cryo-FIB）和冷冻电子断层三维成像（cryo-ET）方法，对细胞核内的染色质进行了原位结构研究（图2）。研究者发现，在生理条件下，蛙血红细胞核内存在着大量的染色质纤维（图3A）。通过对局部核小体排列规律的大量观测，研究者发现这些纤维中局部存在短程较为均一的类似two-start亚单元结构。STA平均结果显示该亚单元的整体扭转较小，核小体表现为相对较为平行的梯状结构，但仍然符合two-start zigzag的排列规律。值得注意的是，通过冷冻电子断层三维成像结合亚单元结构平均（STA）和电压相位板（VPP）衬度增强等方法，研究者首次在蛙血红细胞核内观察到了染色质纤维内相邻核小体（如N, N+1, N+2核小体）之间连接DNA的清晰zigzag轨迹（图3B）。

图2 利用cryo-FIB和cryo-ET方法进行细胞核内染色质原位结构研究

　　通过以上体外、体内的不同染色质纤维结构比较，以及空间密度分割（segmentation）和染色质纤维中核小体之间距离，角度等参数的统计分析，研究者发现，染色质中核小体重复长度（NRL）的变化以及染色质成分组成的异质性（heterogeneous compositions）等主要影响局部核小体的空间构象，但不会改变two-start zigzag结构的折叠方式。由此，研究者提出了一种由连接组蛋白介导形成的染色质纤维普遍的two-start zigzag结构和折叠模式（图3C）。在此模式中，如果核小体的组成均一，则染色质纤维的结构规律性较强。如果核小体的组成或性质不均一，则纤维的整体结构也更不规则，然而短程距离上核小体排列仍然满足two-start zigzag的规律，在局部还会存在结构相对均一的亚结构单元。以上结果对于认识染色质的高级结构组成和折叠形式具有重要意义。

图3 蛙血红细胞核内染色质纤维（A）的双螺旋two-start zig-zag结构（B）和折叠模式（C）

　　中国科学院生物物理研究所朱平研究组副研究员李岩，博士生张浩楠，以及已毕业的博士生李晓敏为该论文的共同第一作者，朱平研究员为论文的通讯作者。该研究工作得到国家自然科学基金、科技部重点研发项目、中国科学院战略性先导科技专项（B类）等的资助。

　　文章链接：

　　https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(23)01146-4

（供稿：朱平研究组）