孙飞/北京大学张传茂课题组在核孔复合体外环结构研究方面获得重要进展

　　2022年1月11日，《Protein & Cell》在线发表了生物大分子国家重点实验室孙飞课题组联合北京大学张传茂课题组等在爪蟾核孔复合体外环结构研究方面的最新成果"8 Å structure of the outer rings of the Xenopus laevis nuclear pore complex obtained by cryo-EM and AI"。该研究获得了分辨率为8埃且近各向同性的核孔复合体外周环的冷冻电镜密度图，并在此基础上搭建了完整的Y复合体结构模型，在胞质环的不对称单位中发现了5个Nup358，2个Nup214复合体，2个Nup205和1个Nup93；在核质环的不对称单位中发现了1个ELYS，1个Nup205和1个Nup93；揭示了这些亚基的空间位置和相互作用关系，使得核孔复合体外周环的结构模型得到了完整的解析，为全面揭示核孔复合体的结构与功能奠定了基础。

　　细胞核是真核生物细胞中最大的细胞器，在细胞核膜上坐落有沟通细胞核质和胞质物质和能量运输的孔道，称为核孔复合体。从胞质侧到核质侧，核孔复合体可以分为胞质纤维，胞质环，内环，腔内环，核质环和核篮。核孔复合体整体呈现为环绕核孔中央孔道的准八重对称空心圆柱状结构，在高等真核生物（如人、爪蟾等）中由约30种、1000多个不同大小的蛋白质亚基构成，分子量可达100兆道尔顿以上。解析核孔复合体的高分辨结构对了解其组装机制和真核生物的起源都有重大意义。但由于其巨大的分子质量和与生理功能相适应的高度动态性，目前核孔复合体依旧缺乏可靠的高分辨率原子结构模型，限制了对其结构和生理功能的深入研究。2020年，西湖大学施一公团队利用冷冻电镜单颗粒分析技术和断层成像技术研究了非洲爪蟾核孔复合体的胞质环及腔内环的结构特征，可以在大多数胞质环组件中识别和定位二级结构元素。今年1月初，美国的Michael Rout研究团队在Cell杂志发表论文，利用综合技术手段研究了酵母核孔复合体在分离纯化状态下的高分辨率结构和在原位生理状态下的相对低分辨率结构，阐明了酵母核孔复合体的模块化组装形式及其与生理功能状态的关系。这些研究都加深了人们对NPC组装机制的理解。

　　孙飞课题组联合北京大学张传茂课题组，针对核孔复合体的样品特性，进一步发展了冷冻电镜单颗粒分析技术，收集了爪蟾卵母细胞核膜在不同倾转角度下的图像数据，从中挑选出了包含各种取向的核孔复合体进行三维重构计算。最终的数据处理结果显示，相比于前人利用电子断层成像进行重构的结果，这种数据收集和处理方法可以达到更高分辨率，其中大部分蛋白质亚基可以达到二级结构分辨率水平。对于核孔复合体的外环（即胞质环和核质环）的不同区域，可以达到8埃左右的整体分辨率。

图1 爪蟾核孔复合体外环的精细结构研究揭示了众多蛋白质亚基的组成和相互作用模式。

　　在此基础上，借助于目前准确率最高的蛋白质三维结构预测软件AlphaFold2，研究人员预测了爪蟾核孔复合体所有核孔蛋白的全长三维结构，并依据高质量的三维重构结果，针对核孔复合体外环的密度图进行模型搭建和结构修正，获得了目前最完整的NPC外环结构模型。这个结构不仅补足了核孔复合体外环结构骨架--Y复合体缺失的部分结构（图1），还在外环上鉴定出一系列发挥重要功能的核孔蛋白亚基，阐明了这些未知组分的精细结构及组装形式。在胞质环上的每个不对称单元上，鉴定出Nup358五元蛋白复合物，发现两个Nup214复合体两两相接构成信使核糖核蛋白出核平台，一个Nup93蛋白发挥桥接作用连接胞质环两个Y复合体的茎部区域，以及两个Nup205蛋白分别发挥稳定胞质环结构的功能。在核质环的每个不对称单元上，鉴定出一个Nup205发挥稳定核质环结构的功能，一个ELYS蛋白发挥起始有丝分裂后期核孔复合体组装的功能，一个Nup93发挥桥接作用连接核质环Y复合体的茎部区域的功能。这些结构信息可以为未来核孔复合体的组装研究提供了重要的参考数据。

　　中国科学院生物物理研究所孙飞研究员和北京大学张传茂教授为本文的共同通讯作者，博士生台林华，研究员朱赟，博士后任合为本文的并列第一作者。该研究得到中科院先导项目、国家自然科学基金委和科技部重点研发项目资助。该研究样品筛选工作在北京大学生命科学学院电镜中心完成，数据收集工作在生物物理所生物成像中心完成，特别感谢生物物理所黄小俊博士在数据收集方面给予的支持和帮助。中国科学院大连化学物理研究所张丽华课题组，香港城市大学范俊教授课题组对本研究也提供了帮助。

　　文章链接：https://link.springer.com/article/10.1007/s13238-021-00895-y

（供稿：孙飞研究组）