噬菌体是地球上数量最庞大的生物群体，是原核生物的病毒，对维持地球生态系统的有序运行意义重大。在噬菌体和宿主漫长的军备竞赛中，为抵御噬菌体的入侵，原核生物进化出了多种系统进行防御，例如限制修饰系统、CRISPR-Cas系统，以及近来不断涌现的多种引起流产感染的系统等。其中，CRISPR-Cas系统是已知的唯一一种适应性免疫系统。相应的，噬菌体进化出了anti-CRISPR蛋白抑制Cas蛋白的切割，从而保持自身基因组完整。

　　在已知的两大类六种类型CRISPR-Cas系统里，第二大类II型的Cas9效应蛋白已被广泛应用于基因编辑，具有简单、高效的优势。针对Cas9的anti-CRISPR蛋白也不断被鉴定。对于anti-CRISPR抑制机理的阐释，不仅可以增进人们对噬菌体与宿主间相互竞争关系的理解，而且有助于后续基因编辑工具的开发。

　　2023年7月26日，中国科学院生物物理研究所王艳丽团队在《PNAS》杂志在线发表了题为"AcrIIC4 inhibits type II-C Cas9 by preventing R-loop formation"的研究论文，揭示了噬菌体anti-CRISPR蛋白AcrIIC4抑制宿主Cas9监测复合物切割双链DNA活性的分子机制。

　　AcrIIC4由副流感嗜血杆菌的前噬菌体编码，对II-C型Cas9具有广谱抑制活性。体外和体内实验均表明，AcrIIC4在基因编辑过程中能高效抑制Cas9的活性，具有被开发为基因编辑调控工具的潜力。然而，由于缺乏AcrIIC4和Cas9复合物的结构，AcrIIC4发挥抑制的精确机制还不明确，而且在其能否阻止DNA结合方面存在争议。

图. AcrIIC4抑制Cas9活性的机理

　　针对上述科学问题，该研究解析了Cas9，向导RNA (sgRNA)，AcrIIC4和靶标DNA之间的一系列结构，发现AcrIIC4结合到Cas9的两个识别结构域REC1和REC2之间，并与sgRNA建立了广泛相互作用，这样能限制住柔性较大的REC2结构域的运动(图A)。结构比较发现，有AcrIIC4存在时，靶标链(TS)和sgRNA只能形成七个碱基的异源双链配对，R-loop的形成被阻止在中间步骤。这与生化实验证据相印证：AcrIIC4能降低、但不完全阻止Cas9与DNA的结合。进一步的实验证明，AcrIIC4能阻止双链DNA在PAM远端解链(图B)，并对TS-guide RNA结合通道的形成有影响，从而阻止完整R-loop的形成，终止后续别构激活(图C)。此外，AcrIIC4抑制II-C型Cas9不同同源蛋白的能力差异较大。该研究通过一级序列和三维结构比对，结合体外切割实验，证明了sgRNA的第一个茎环长度的不同是导致这种差异的原因。这一发现对在不同Cas9编辑系统中应用AcrIIC4具有指导意义。

　　中国科学院生物物理所王艳丽研究员为本文的通讯作者，孙伟副研究员为第一作者，娄继忠研究员在抑制机理的实验设计方面给予了重要指导。本研究得到了国家自然科学基金委、中国科学院战略性先导科技专项(B类)和中国科学院青年创新促进会等的项目资助。生物物理所生物成像中心和科学研究平台分别为电镜数据收集和静态光散射实验提供了技术支持。

　　文章链接：

　　https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2303675120

（供稿：王艳丽研究组）