CRISPR/Cas系统是广泛存在于细菌和古菌中抵抗病毒、质粒等外源核酸的获得性免疫系统。II型的Cas9在RNA的介导下可以特异性的识别、切割dsDNA，具有可编辑性。因此被广泛用作基因编辑工具。由于其重要性，Cas9被系统地研究，大量的文献报道了Cas9的原子分辨率结构、单分子测量结果、分子动力学模拟计算结果，阐明了Cas9切割DNA的分子机理。但是，之前发表的Cas9结构中，切割目的DNA的HNH催化口袋远离切割位点，Cas9处于非活性的状态。而活性状态下的结构是真正理解Cas9切割DNA的作用机制所必需的。另外，目前被广泛使用的SpyCas9，因受其大小的限制，很难与sgRNA一起通过单一AAV病毒导入。而近年来新鉴定的NmeCas9则由于其相对比较小和脱靶率低的原因，有望成为一个更好的编辑工具，但其分子机制尚未被揭示。
噬菌体编码的具有抑制CRISPR-Cas系统功能的蛋白被称为anti-CRISPR蛋白，这些蛋白可以作为基因编辑开关，调控Cas9的活性。2016年，多伦多大学的Karen Maxwell课题组首次报道了AcrIIC1、AcrIIC2和AcrIIC3三种可以抑制NmeCas9的anti-CRISPR蛋白。王艳丽课题组曾与Maxwell课题组合作阐明了AcrIIC2通过阻碍Cas9与sgRNA的结合抑制Cas9活性的机制；但是目前AcrIIC3的抑制机理还不清楚。
2019年10月24日，王艳丽课题组的研究论文“Structures of Neisseria meningitidis Cas9 Complexes in Catalytically Poised and Anti-CRISPR Inhibited States”在《Molecular Cell》杂志在线发表。该工作报道了NmeCas9的五种不同的状态：sgRNA结合状态、种子区域配对状态、催化前状态、催化状态、切割后产物结合状态的高分辨率结构。这些结构如同电影一样，逐步展示了Cas9切割目的DNA的每一个过程，同时揭示了两种不同的NmeCas9识别两种不同PAM的分子机制，进一步揭示了Cas9切割DNA的分子机制。同时，该工作还报道了AcrIIC3分别与sgRNA结合状态、DNA结合状态Nme1Cas9的复合物结构，揭示了AcrIIC3抑制Nme1Cas9切割活性的分子机理。
Cas9与sgRNA结合形成功能复合物，然后Cas9-sgRNA复合物读取目标DNA的PAM序列，解开目的DNA双螺旋，同时sgRNA和目的DNA配对，产生R-loop，随后Cas9的HNH与RuvC活性中心分别切断DNA的两条链。本研究中的种子区域配对状态的结构，成功捕捉到双螺旋形成的中间过程，即sgRNA识别、结合目的DNA的状态（图1A）。更值得注意的是研究者解析了Cas9 HNH处于催化状态的结构（图1B），并第一次观察到金属离子与HNH活性中心的结合。而上述这两种状态是首次被观测到。
Cas9的HNH结构域具有非常高的柔性，并倾向处于远离切割位点的部位，使得Cas9易处于非活性状态。研究者对HNH结构域进行改造，增强了HNH结构域与目的DNA的相互作用，提高了NmeCas9切割DNA的活性。同时，HNH的催化状态激活RuvC切割另一DNA链的活性。因此，HNH结构域改造后的Cas9切割目的DNA两条链的活性同时得到增强。
为了阐明AcrIIC3抑制NmeCas9活性的分子机理，研究者解析了AcrIIC3和结合sgRNA的NmeCas9形成复合物的结构，以及和结合了sgRNA、DNA的NmeCas9形成复合物的结构。研究表明，两个AcrIIC3单体连接两个NmeCas9复合物（图1C）。AcrIIC3与NmeCas9之间的相互作用将HNH结构域锚定在非活性状态，从而抑制NmeCas9对DNA的切割。
图1. NmeCas9-sgRNA-DNA复合物三种不同状态的晶体结构。
A. 种子区域配对状态；B.催化状态；C. AcrIIC3抑制状态。
这项工作还给大家展示了两种NmeCas9切割DNA的中间状态以及产物结合状态，进一步阐述了Cas9切割DNA的分子机理。需要指出的是，在论文评审过程中，《Nature Structural & Molecular Biology》杂志报道了处于切割后状态的SpyCas9三元复合物结构，整体分辨率3.37angstrom，但是局部的HNH分辨率比较低。王艳丽组报道的催化状态中Cas9三元复合物结构的分辨率更高，为Cas9的改造与应用提供了更有力的理论基础；同时揭示了AcrIIC3抑制NmeCas9切割双链DNA的分子机理 （图2）。
中国科学院生物物理所王艳丽研究员和美国麻省大学医学院Erik Sontheimer教授为本文的共同通讯作者。王艳丽课题组的孙伟、杨晶、程志为本文的共同第一作者。该研究得到科技部、国家自然科学基金以及中国科学院的资助，上海同步辐射光源（SSRF）及日本同步辐射光源（SPring-8）为该研究提供了重要的技术支持。
图2. NmeCas9切割DNA以及受AcrIIC3抑制的模型。
文章链接：https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(19)30730-0
（供稿：王艳丽研究组）
