2023年4月5日，Cell Chem (IF:25.83)期刊发表了王江云课题组、华中科技大学钟芳锐课题组题为"Whole-cell-catalyzed hydrogenation/deuteration of aryl halides with a genetically repurposed photodehalogenase"的研究文章。文中报道了一种编码在黄色荧光蛋白中的二苯甲酮光催化剂，称为还原性光卤化酶（RPDase），可以有效地介导芳基卤化物的生物催化加氢脱卤和氘化脱卤。与为特定底物的生物修复而进化的天然金属辅因子依赖性脱卤酶不同，这种不含金属的光酶通过完全非天然的催化机制与甲酸盐结合，并表现出显著的底物通用性。基于RPDase和遗传密码子扩展方法，我们首次证明了使用表达RPDas的重组大肠杆菌细胞可以进行全细胞光生物催化，有价值的化学品生产有望实现生物代谢。

　　自然进化在很大程度上是由环境压力驱动和塑造的，因此产生了各种在分子水平上具有结构和功能多样性的酶。例如，卤代芳烃通常是有毒、危险的，通常也是人为来源的持久性有机卤化物，可以被有机卤化物呼吸细菌有效降解。编码脱卤酶的基因已经被鉴定，大自然根据不同底物的类型创造了不同的脱卤酶，包括脂肪族有机卤化物的水解脱卤酶，携带钴酰胺辅因子（维生素B12），将电子从牺牲还原剂（如NADPH）穿梭到芳基或烯基卤化物底物还原性脱卤酶等，基于它们的天然来源，这些酶通常对特定的底物有效。NprdhA，一种从巨大芽孢杆菌中获得的还原性脱卤酶，对含有2,6-二卤酚部分的底物表现出明显的偏好。据推测，B12辅因子会攻击底物的卤素原子，导致碳卤素键断裂，并伴随离去基团的质子化。

　　尽管天然脱卤酶的催化机制多种多样，有机卤化物底物的多样性仍在不断增加，它们的脱卤效率基本上受到了天然辅因子和天然氨基酸种类有限的限制。已测量到典型芳基卤化物的标准还原电势为-0.99 V和-2.59 V之间，而用于降解四氯乙烯的天然钴酰胺依赖性还原脱卤酶中Co（II）/Co（I）对的氧化还原电位为~-0.38 V，结合他们的底物特异性使得很难处理对还原高活性的各种芳基卤化物。将合成辅因子引入天然蛋白质将赋予酶新的化学反应活性，可以补充自然界进化的酶。设计人工脱卤酶，可以利用非天然催化剂的反应性来进行合成化学中发展的脱卤反应，从而实现高价值的化学合成。

　　生物物理所王江云课题组基于基因密码子扩展技术实现了多种具有特殊物理化学性质的非天然氨基酸在蛋白质中的编码。前期研究发现通过使用基因密码子扩展技术可以将二苯甲酮非天然氨基酸插入荧光蛋白，从而改造发色团光驱动生成具有高还原活性的物种，用于驱动二氧化碳光还原，芳香化合物脱卤羟化，功能铁硫簇蛋白的还原等（Nat. Chem., 2018；ACS. Catal., 2021, 2023;CCS Chem.,2021; Acc. Chem. Res.，2019; JACS., 2021），在这些工作中发展的光敏蛋白质表现出优异的光化学性质。

　　在这项研究中我们发现在编码二苯甲酮非天然氨基酸的光敏蛋白质可以有效催化各种芳基卤化物的还原脱卤。基于光敏蛋白质发展的还原性光卤化酶（RPDase）通过一种非天然的机制运作，甲酸钠作为牺牲还原剂，光化学产生强还原性的含二苯甲酮发色团阴离子自由基。这与B12依赖性天然脱卤酶与NADPH偶联完全不同。RPDase可容纳多种芳基碘化物、芳基溴化物和芳基氯化物。此外，它适用于氘化药物分子的制备和形成C-C键的自由基加成反应，并且它在大肠杆菌（E.coli）细胞中作为全细胞生物催化剂也表现良好。研究表明，使用遗传密码扩展技术将合成光氧化还原催化与天然蛋白质相结合，可以创造出有趣的人工光合机制，从根本上扩展生物催化的范围。基于生物正交和可持续的光合作用，有望实现有价值的非天然化学制造，设计微生物细胞工厂。

　　该工作由中国科学院生物物理研究所和华中科技大学合作完成。生物物理研究所核酸生物学重点实验室王江云研究员和华中科技大学钟芳锐教授、吴钰周教授为本文的共同通讯作者，华中科技大学博士后付雨和中国科学院生物物理研究所刘晓红研究员为本文共同第一作者。生物物理所博士生夏颜，郭旭祯参与了研究工作。该研究得到科技部、国家自然科学基金委和中科院的经费支持。感谢生物物理所蛋白质科研平台提供的帮助。

生物催化还原脱卤酶催化

　　文章链接：https://doi.org/10.1016/j.chempr.2023.03.006

（供稿：王江云研究组）