2012年3月13日,德国应用化学(Angewandte Chemie)在线发表了中国科学院生物物理研究所王江云课题组和University of Illinois at Urbana-Champaign化学系陆艺教授课题组的最新合作研究成果：“Xiaohong Liu, Yang Yu, Cheng Hu, Wei Zhang, Yi Lu, Jiangyun Wang “Dramatic Increase of Oxidase Activity through the Genetic Incorporation of Tyrosine-Histidine Crosslink in a Myoglobin Model of Heme-Copper Oxidase” Angew. Chem. Intl. Ed. (DOI: 10.1002/anie.201108756 )”。本研究利用非天然氨基酸的定点插入, 首次实现了用18kD 的肌红蛋白模拟呼吸链中重要膜蛋白复合物细胞色素c氧化酶。此工作首次提供了细胞色素c氧化酶中保守翻译后修饰Tyr-His 功能的直接证据，是蛋白质设计领域的重要进展，并有望在生物能学中获得重要应用。

　　细胞色素c氧化酶（CcO）即呼吸链复合体IV，是线粒体氧化呼吸的限速酶，它直接参与线粒体中氧气的还原和质子梯度产生，它的损伤影响线粒体功能，导致大量产生活性氧。由于CcO在能量产生和调节中的重要地位，自它被发现以来一直是生物研究领域中重要的研究课题。X-射线晶体结构衍射研究发现哺乳动物或细菌中都含有经翻译后修饰形成的Tyr-His 共价交联，但因受技术手段的限制及缺乏直接的证据，对于共价交联Tyr-His的确切作用目前仍是科学研究争议的焦点。

　　通过人工进化的方法可以增加非天然氨基酸的新基因编码。首先把无意密码子“UAG”确定为新的遗传密码，然后对天然的组装核糖核酸（tRNA）突变，使其含有反密码子“CUA”。在此基础上从氨酰-tRNA合成酶突变库中，筛选出可专一结合这种tRNA和指定非天然氨基酸的氨酰-tRNA合成酶突变体。在这之后，再将生命体中mRNA上任意一个遗传密码取代为UAG，并在培养基中加入化学合成的非天然氨基酸，就可以在蛋白质中相应的位置插入有特殊物理性质、化学性质的非天然氨基酸。本研究首先筛选得到了对含有Tyr-His共价交联特征元素的3-咪唑基酪氨酸特异性识别的氨酰-tRNA合成酶，并将该非天然氨基酸插入到了模型蛋白Myoglobin中。再将Mb 活性中心空穴内的氨基酸Leu29 突变成His，Phe33 突变为3-咪唑基酪氨酸，实现了催化还原氧气转化为水分子，产生小于6%的活性氧，催化转化数超过1000，催化剂未出现明显降解。作为对照，我们构建了突变体Leu29His/Phe33Tyr/Phe43His （F33YCuBMb），其中，29位，43位和64位His可以形成一个铜离子结合位点，而33Tyr和43His在Mb上的位点及结构与imiTyrCuBMb中33位imiTyr的咪唑基团及酚基团类似，但没有形成共价交联。相比imiTyrCuBMb，F33YCuBMb将50%的O2转化成了ROS。这一研究结果表明了Tyr-His 翻译后修饰共价交联的重要性。在此基础上，我们将能进一步利用非天然氨基酸定点插入及定向进化提高细胞色素c氧化酶模型蛋白的活性，并将其应用到生物电极中。

　　生物物理研究所刘晓红副研究员为本文的第一作者。该研究得到科技部国家重点基础研究973计划、国家自然科学基金委员会的资助

图1：在肌红蛋白中编码含Tyr-His共价交联元素的3-咪唑基酪氨酸模拟细胞色素c氧化酶的功能。

（科技处报道）

（供稿：刘晓红）