食源性致病菌的污染是非常普遍的现象。根据世界卫生组织在2015年公布的数据，全球每年6亿例食源性疾病患者中有5.5亿例是由腹泻型传染性病原体引起的，可以造成23万人死亡[1]。因此，准确快速灵敏地检测食源性致病菌对于保证食品安全和人类健康是至关重要的。幸运的是，现在我们拥有可以"锁定"食源性致病菌的新型检测工具--CRISPR/Cas系统。简单来说，目前CRISPR/Cas系统可分为两类，即利用多 Cas 效应蛋白复合物来发挥作用的第一类系统和利用单Cas效应蛋白的第二类系统。常用于检测领域的则是第二类CRISPR/Cas系统，其单Cas效应蛋白拥有多个功能区域，具有特异性强、灵敏度高和操作方便等优点[2]。此外，纸作为一种可降解、重量轻、成本低的材料，将其作为检测信号输出的方式将使分析检测方法具有操作简便、成本低廉等优势。

纸基分析系统的运用

　　试纸分析。我们将可以发生颜色变化的物质固定在纸上，当加入含有目标检测物的溶液后，目标检测物与纸基固定物质可以发生化学反应，最终产生颜色变化，即可完成对样品的检测。例如，科学家们利用Cas9蛋白开发了一个针对寨卡病毒的纸基检测方法，当寨卡病毒存在时，由于Cas9蛋白的作用，使得前置反应无法产生LacZ酶--可以使固定在试纸上的物质发生颜色变化，由此可以判断检测病毒是否存在[3]。除此之外，还有其他的形式可以使试纸上发颜色变化，例如提前将CRISPR/Cas13a系统的反应试剂通过冻干的方式固定在试纸上，然后加入检测目标核酸来激活CRISPR/Cas13a系统，最终通过试纸上的荧光强度来判断是否存在目标物。

　　侧向流动分析试纸条。相信大家对侧向流动分析试纸条并不陌生。通常情况下，我们将可能含有目标物的样品滴加到试纸条的样品垫上，它就可以通过毛细管力将样品迁移到结合垫上，目标物可以与结合垫的标记材料结合在一起，然后继续在试纸条上迁移，继而与硝酸纤维素膜上的反应元件结合，最终到达吸水垫，这就是样品在试纸条上反应的全过程。使用者可以通过硝酸纤维素膜上的测试线（T线）与控制线（C线）的颜色变化来判断样品中是否含有目标物。试纸条的信号输出和判别方式特别简单，把CRISPR/Cas系统可检测食源性致病菌的特性与试纸条的信号输出方式结合起来，将会使食源性致病菌的检测更加方便快捷。如图所示，研究者们利用生物素-链霉亲和素系统，把CRISPR/Cas系统所使用的信号报告探针作为检测对象，通过试纸条中T/C线的显色与否可以反映探针的完整或断裂状态，以此来判断检测物中是否含有食源性致病菌。除了使用生物素-链霉亲和素作为连接系统外，研究者们还使用单链DNA之间的碱基互补配对作为连接系统，其原理与上述的试纸条原理类似，同样反映了CRISPR/Cas系统的信号报告探针的状态是否完整。目前，这些形式的试纸条已经广泛应用在金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和蜡样芽孢杆菌等食源性致病菌的检测中[4-5]。

　　纸基微流控装置。微流控装置是将样品制备、反应、分离和检测分析等实验操作集成到一个微米级的芯片中，芯片通常可由玻璃、石英、高分子材料、水凝胶和纸等多种材料构成，具有自动化、小型化、高通量和低成本的特点[6]。近年来，许多研究者将CRISPR/Cas系统的检测性能与纸基微流控装置联合起来，期望开发出检测食源性致病菌的有力工具，例如将CRISPR/Cas12a、纸基微流控与表面增强拉曼光谱联用检测沙门氏菌，在纸基微流控装置上集成水凝胶技术用于真菌的定量检测等[7-8]。尽管以上联用了CRISPR/Cas系统的微流控装置具有许多优点，但是基于纸基的微流控装置仍存在疏水性差、拉伸强度低等缺点，这意味着在开发过程中需要注意纸基材料的选择[9]。

小结与展望

　　研究者们基于CRISPR/Cas系统在食源性致病菌检测方面开发了大量具有高灵敏度、高特异性、快速简便的生物传感器和纸基分析方法，但CRISPR/Cas系统和纸基材料固有的纤维素结构等因素都有可能使检测方法在实际应用时面临挑战。在现场检测中，复杂的样品基质可能会影响检测效果，需要对检测样品进行提取和纯化等操作的预处理，因此开发简便有效的样品提取装置也是提高检测效率的重要手段。另外在构建基于CRISPR/Cas系统的纸基分析方法的过程中，大多会涉及到核酸提取、扩增和检测3个主要步骤，如果可以将这3个步骤集成在同一个试纸条或微流控装置中，其简便性和检测效率会得到很大提高。

　　总体来说，CRISPR/Cas系统与纸基分析结合具有非常可观的发展前景，但目前两者结合建立的分析方法分为CRISPR/Cas检测和纸基分析两个步骤组成，如果将Cas蛋白以保留活性的方式直接整合在纸基材料并建立简便的一步纸基分析方法，这将具有巨大的应用潜力和商业化前景，值得研究者们进一步探索。（详情请点击阅读原文）

　　参考文献

　　[1] Word Health Organization. WHO Estimates of the Global Burden of Foodborne Diseases: Foodborne Disease Burden Epidemiology Reference Group 2007-2015. Switzerland: World Health Organization Press, 2015: 61-89

　　[2] Wang S Y, Du Y C, Wang D X, et al. Signal amplification and output of CRISPR/Cas-based biosensing systems: a review. Anal Chim Acta, 2021, 1185: 338882

　　[3] Pardee K, Green A A, Takahashi M K, et al. Rapid, low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell, 2016,165(5):1255-1266

　　[4] Qian J, Huang D, Ni D, et al. A portable CRISPR Cas12a based lateral flow platform for sensitive detection of Staphylococcus aureus with double insurance. Food Control, 2022,132: 108485

　　[5] Bao Q, Sun J, Fu X, et al. A simplified amplification-free strategy with lyophilized CRISPR-CcrRNA system for drug-resistant Salmonella detection. Small, 2023,19: 2207343

　　[6] Zhou W, Le J, Chen Y, et al. Recent advances in microfluidic devices for bacteria and fungus research. Trend Anal Chem, 2019,112: 175-195

　　[7] Zhuang J, Zhao Z, Lian K, et al. SERS-based CRISPR/Cas assay on microfluidic paper analytical devices for supersensitive detection of pathogenic bacteria in foods. Biosens Bioelectron, 2022,207: 114167

　　[8] Huang D, Ni D, Fang M, et al. Microfluidic ruler-readout and CRISPR Cas12a-responded hydrogel-integrated paper-based analytical devices (μReaCH-PAD) for visible quantitative point-of-care testing of invasive fungi. Anal Chem, 2021,93(50):16965- 16973

　　[9] Qin X, Liu J, Zhang Z, et al. Microfluidic paper-based chips in rapid detection: current status, challenges, and perspectives. Trend Anal Chem, 2021,143: 116371

　　作者简介

　　李鹏儒：华南农业大学硕士研究生，主要致力于食源性致病菌核酸分子检测与免疫检测相关研究。

　　徐振林：华南农业大学食品学院教授，主要从事食品安全与营养科研教学工作。

（作者：李鹏儒、徐振林）

（本文来源于公众号：生物化学与生物物理进展）