生物成像中心成功研发基于高真空冷台的

　　2017年11月4日，Journal of Structural Biology杂志在线发表了中科院生物物理所蛋白质科学研究平台生物成像中心（以下简称“成像中心”）的研究论文“High-vacuum Optical Platform for cryo-CLEM (HOPE): a New Solution for Non-integrated Multiscale Correlative Light and Electron Microscopy”，该文详细阐述了成像中心自主研发的基于高真空冷台的光电关联成像新技术HOPE：High-vacuum Optical Platform for cryo-CLEM，该研究设计了一种新型的可用于冷冻样品光电关联成像的高真空光学冷台，系统可与透射电镜冷冻样品杆适配连接，完成荧光定位后样品将随冷冻样品杆一起被转移进电镜当中进行高分辨率数据采集。

　　冷冻电镜高分辨率三维重构技术可以获得生命体内的超微结构甚至相关分子机器在细胞原位的三维结构信息，从而有助于分析总结出目标分子机器在生理状态下的结构功能与工作机制，而荧光特异性标记可以有效弥补电镜技术中生物样品衬度低以及缺少特异标记的不足，由此应运而生的光电关联成像技术可以实现从微观尺度到介观尺度的目标区域精确定位和原位超微结构解析的优势整合。然而，当前研究前沿提出的光电关联成像冷台在设计中多是采用液氮浸泡制冷，其中液氮震动造成的样品损伤以及关联成像过程中对冷冻样品及其载网的损坏都是影响冷冻光电关联成像技术的成功率及其在生物学研究中的应用的难题。为了攻克这一技术难题，成像中心提出了一种高真空光学冷台的设计思想，自行研发了一套基于高真空光学冷台的光电关联成像系统（HOPE），该系统中的硬件主体——高真空冷台，可以搭载在宽场荧光显微镜上实现冷冻荧光成像，并可与透射电镜冷冻样品杆适配连接，完成荧光定位成像后，样品将随冷冻样品杆一起被转移进电镜当中进行高分辨率数据采集，同时结合光电关联定位软件，可以实现大视野光学定位成像与电镜成像的精确匹配，有效提高关联成功率和数据采集效率。

　　较之于商业化的光电关联成像系统（FEI iCorr，CorrSight, Leica Cryo-CLEM等），HOPE可以独立搭载在不同的商业化荧光显微镜上，系统操作便捷；冷冻样品杆自身带有冷却装置；腔室真空设计可以有效隔离冷冻样品与光学物镜镜头之间的热传递，使该系统不必使用特殊设计的物镜镜头，同时也避免了光学成像窗口、腔壁结露甚至结霜的问题。该系统是对现有冷冻成像技术的提升和扩展，大大降低了冷冻光电关联成像的技术门槛，提高了实验的稳定性和可靠性。

　　在完成高真空冷台硬件主体的设计与优化的基础上，项目组选择大鼠海马神经元和大肠杆菌作为测试样品，基于HOPE冷冻光电关联成像系统成功获得了带有荧光标签的目标区域的冷冻电镜原位超微结构成像，并完成了数据处理和三维重构。该研究为相关领域研究者们提供了一种新型的冷冻光电关联成像技术，对于原位结构生物学的研究具有重要作用。

　　孙飞研究员与季刚正高级工程师为文本的共同通讯作者，生物成像中心的李硕果工程师和季刚正高级工程师为本文的共同第一作者。本该课题获得中科院先导B项目、中科院仪器设备功能开发技术创新项目和国家自然科学基金的支持。孙飞组博士生师扬、王圣柳，丹麦Aarhus University的Mingdong Dong课题组与孙飞组联合培养博士后Lasse Hyldgaard Klausen，生物成像中心黄小俊高级工程师、丁玮高级工程师、牛彤欣工程师，徐涛组张翔工程师等也参与了该课题的研究。本研究项目中所涉及的冷冻电镜成像、结构光照明超分辨荧光成像及图像数据处理工作等均在蛋白质科学研究平台生物成像中心完成。

　　项目组自主设计制作的高真空光学冷台已经获得中国发明专利（ZL 201410363314.8）及美国发明专利（15/500,009）授权。　

图1 左图：HOPE实物结构示意图；右图：光电关联实验流程示意图：低倍冷冻荧光（10X）图片快速筛选目标所在区域；对荧光信号合适的目标区域进行高倍荧光成像（40X）；光电关联匹配图像进一步锁定目标区域；对荧光信号区域内的目标样品进行逐步放大；锁定成像目标；对目标样品进行高分辨率三维数据采集。

　　文章链接:https://doi.org/10.1016/j.jsb.2017.11.002

（供稿：蛋白质科学研究平台生物成像中心）