基于CRISPR/Cas的分子检测

　　分子检测技术已广泛应用于生命科学、食品安全、环境监测和临床诊断等各个方面，然而传统检测技术已经无法满足现阶段分子检测行业的需求，因此必须寻找新的分子检测技术，弥补现有技术的不足。其中以CRISPR/Cas系统为代表的新兴分子检测技术具有检测时间短、特异性高、适合即时检测（point-of-care testing，POCT）等优势，已经开始逐渐进入分子检测领域。

　　CRISPR/Cas是（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associate）成簇规律间隔短回文重复序列及相关蛋白质缩写，它是微生物的天然"免疫系统"[1]。从1987年大肠杆菌（Escherichia coli）中发现CRISPR/Cas系统，到2002年命名为CRISPR/Cas[1]，2007年证明了CRISPR/Cas是细菌的一种适应性免疫系统，2011年揭示CRISPR/Cas的分子机制，2012年科学家初步证明了CRISPR/Cas系统具有基因编辑功能[2]。从此以后，CRISPR/Cas技术开启生命科学领域的新时代，CRISPR/Cas相关研究成果频频登上Cell、Nature、Science等顶级期刊。更为耀眼的是 2020年10月7日，瑞典皇家科学院宣布2020年诺贝尔化学奖授予埃马纽埃尔·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）和詹妮弗·杜德纳（Jennifer A. Doudna)，以表彰她们在"基因编辑方法"研究领域的贡献。CRISPR/Cas技术已经广泛应用医药卫生、农业、工业等相关领域。主要的用途有基因编辑、分子诊断、基因表达调控等。

　　也许一提到CRISPR/Cas技术，人们的第一反应是，CRISPR/Cas技术是一个高效的基因编辑系统。其实，CRISPR/Cas系统是一个多面手，不仅具有高效基因操作功能，还具有分子检测能力。本文带您了解一下CRISPR/Cas高效的分子检测能力，CRISPR/Cas系统不但可以检测核酸分子（DNA/RNA），还可以检测非核酸分子（小分子化合物、重金属、蛋白质、肿瘤循环细胞、外泌体等）[3]（图1）。参与分子检测常见的CRISPR/Cas系统有CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13和CRISPR/Cas14。

图1 CRISPR/Cas分子检测分类示意图

核酸分子检测

　　CRISPR/Cas系统在引导RNA（guide RNA，gRNA）的引导下识别目标核酸（DNA/RNA）序列后，激活Cas蛋白对靶向和非靶向核酸（DNA/RNA）分子切割。CRISPR/Cas系统在靶向识别和切割过程中转化靶标核酸分子信号为检测仪器或肉眼可观察的信号[4-6]（图2）。

　　依据检测核酸分子类型，CRISPR/Cas技术核酸检测可分为DNA（CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas12识别DNA序列）和RNA（CRISPR/Cas13识别RNA序列）检测（图1）。不同的CRISPR/Cas系统识别的核酸类型不同，然而检测过程中为了实现同一个CRISPR/Cas系统对DNA和RNA均能够检测，必须借助于转录技术（transcription，T）和逆转录（reverse transcription，RT）实现DNA与RNA的相互转化。

　　依据CRISPR/Cas系统检测核酸分子过程中是否需要体外核酸扩增，CRISPR/Cas技术核酸检测可分为辅助体外核酸扩增检测和无体外核酸扩增检测（图1）。辅助体外核酸扩增检测过程：首先应用PCR、重组酶聚合酶等温扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）、环介导等温扩增（loop mediated isothermal amplification，LAMP）等技术对靶向核酸序列进行体外扩增[7]，然后再通过CRISPR/Cas对靶标分子检测。而基于CRISPR/Cas技术的无体外核酸扩增检测技术，可实现直接检测靶标核酸，此过程操作步骤少、检测时间短、污染少。

　　基于CRISPR/Cas建立的核酸检测系统，可有效地转化靶向DNA分子信号为检测工具或肉眼可观察的荧光信号、化学信号、电化学信号等，实现靶标核酸信号分子的检测[8]（图2）。目前已应用于寨卡、乙脑病毒、非洲猪瘟、严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的核酸检测，以及DNA甲基化、HPV16 and 18基因分型等[1]。尤其是基于CRISPR/Cas13建立的无需体外核酸扩增的SARS-CoV-2核酸检测系统，检测的极限为~31拷贝/μl，时间为20 min[1]。基于CRISPR/Cas13建立的多通道荧光信号核酸分子检测系统，一次性可以检测169种与人类相关的病毒核酸，具有高通量、快速、低成本等优点。

非核酸分子检测

　　目前应用于非核酸分子检测的CRISPR/Cas系统主要有Cas12a和Cas13a。CRISPR/Cas12a可以有效地检测外泌体，此过程通过适配体技术与CRISPR/Cas12a技术联合，转化外泌体信号为仪器可检测信号[9]。随着对CRISPR/Cas分子检测技术研究的逐步深入，检测的靶标分子类型也逐渐丰富，可实现循环肿瘤细胞、小分子化合物、蛋白质分子、金属离子、酶活性、抗生素、病原微生物等靶标检测。检测样本类型从单一逐步走向复杂多样，涵盖人的血液、体液、牛奶、食品、环境样本等。伴随着检测系统的优化，检测时间从120 ~20 min逐渐缩短，可实现POCT[10]。CRISPR/Cas检测的靶标分子从病原微生物到小分化合物，凸显了CRISPR/Cas可检测非核酸靶标分子的广泛性、样本类型的普遍性以及检测操作的便捷性，非常适合海关、车站、学校等场所的POCT。（详情请点击阅读原文）

图2 CRISPR/Cas分子检测流程示意图

　　CRISPR/Cas分子检测技术作为一种新兴检测技术，能够适应复杂多样化的样本、检测时间短、操作流程简单、灵敏度和特异性高，不需要昂贵的仪器设备和专业的实验环境，非常适合现阶段分子检测市场的需求。

　　参考文献

　　[1] Soh J H, Balleza E, Abdul Rahim M N, et al. CRISPR-based systems for sensitive and rapid on-site COVID-19 diagnostics. Trends Biotechnol, 2022, 40(11): 1346-1360

　　[2] Makarova K S, Wolf Y I, Iranzo J, et al. Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants. Nat Rev Microbiol, 2020, 18(2): 67-83

　　[3] Huang T, Zhang R, Li J. CRISPR-Cas-based techniques for pathogen detection: retrospect, recent advances, and future perspectives. J Adv Res, 2022, 50: 69-82

　　[4] Fonfara I, Richter H, Bratovic M, et al. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA. Nature, 2016, 532(7600): 517-521

　　[5] Ackerman C M, Myhrvold C, Thakku S G, et al. Massively multiplexed nucleic acid detection with Cas13. Nature, 2020, 582(7811): 277-282

　　[6] O'connell M R, Oakes B L, Sternberg S H, et al. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature, 2014, 516(7530): 263-266

　　[7] Li L, Shen G, Wu M, et al. CRISPR-Cas-mediated diagnostics. Trends Biotechnol, 2022, 40(11): 1326-1345

　　[8] Mustafa M I, Makhawi A M. SHERLOCK and DETECTR: CRISPR-Cas systems as potential rapid diagnostic tools for emerging infectious diseases. J Clin Microbiol, 2021, 59(3): e00745-e00720

　　[9] Ding L, Wu Y, Liu L-E, et al. Universal DNAzyme walkers-triggered CRISPR-Cas12a/Cas13a bioassay for the synchronous detection of two exosomal proteins and its application in intelligent diagnosis of cancer. Biosens Bioelectron, 2023, 219:114827

　　[10] Zhou J, Ren X M, Wang X, et al. Recent advances and challenges of the use of the CRISPR/Cas system as a non-nucleic acid molecular diagnostic. Heliyon, 2023, 9(12): e22767

　　作者简介

　　周建：西安医学院第一附属医院副主任技师，研究方向为核酸分子诊断。

　　李卓：西安医学院第一附属医院教授，研究方向为肿瘤分子诊断。

　　任雪梅：西安医学院第一附属医院技师，研究方向为分子免疫。

（作者：周建、李卓、任雪梅）

（本文来源于公众号：生物化学与生物物理进展）